Nested PCR

Dari Wikipedia bahasa Indonesia, ensiklopedia bebas
Langsung ke: navigasi, cari
Reaksi PCR

Nested PCR adalah suatu teknik perbanyakan (replikasi) sampel DNA menggunakan bantuan enzim DNA polymerase yang menggunakan dua pasang primer untuk mengamplifikasi fragmen.[1] Pasangan primer yang pertama akan mengamplifikasi fragmen yang cara kerjanya mirip dengan PCR pada umumnya.[1] Sedangkan, pasangan primer yang kedua biasanya disebut nested primers (sepasang primer tersebut terletak di dalam fragmen pertama) yang berikatan di dalam fragmen produk PCR yang pertama untuk memungkinkan terjadinya amplifikasi produk PCR yang kedua dimana hasilnya lebih pendek dari yang pertama.[1] Dengan menggunakan nested PCR, jika ada fragmen yang salah diamplifikasi maka kemungkinan bagian tersebut diamplifikasi untuk kedua kalinya oleh primer yang kedua sangat rendah.[1][2] Dengan demikian, nested PCR adalah PCR yang sangat spesifik dalam melakukan amplifikasi.[1]

Perbedaan Nested PCR dengan PCR biasa[sunting | sunting sumber]

Nested PCR merupakan variasi dari reaksi polymerase chain reaction biasa (PCR).[1] Nested PCR dan PCR biasa keduanya berguna untuk memperbanyak fragmen DNA tertentu dalam jumlah banyak.[1][2] Pada nested PCR digunakan 2 pasang primer sedangkan pada PCR biasa hanya menggunakan 1 pasang primer.[1] Oleh karena itu, hasil fragmen DNA dari nested PCR lebih spesifik (lebih pendek) dibandingkan dengan PCR biasa.[1] Waktu yang diperlukan dalam reaksi nested PCR lebih lama daripada PCR biasa karena pada nested PCR dilakukan 2 kali reaksi PCR sedangkan pada PCR biasa hanya 1 kali reaksi PCR.[1] Selain itu, keuntungan nested PCR adalah meminimalkan kesalahan amplifikasi gen dengan menggunakan 2 pasang primer.[1][2]

Mekanisme kerja[sunting | sunting sumber]

Secara umum, PCR adalah suatu proses perbanyakan DNA secara in vitro melalui beberapa tahap, yaitu denaturasi, penempelan primer, dan pemanjangan.[3] Prinsip kerja nested PCR tidak jauh berbeda dengan PCR biasa, namun nested PCR akan bekerja menggunakan dua pasang primer untuk mengamplifikasi fragmen DNA spesifik melalui dua proses PCR secara terpisah.[3] Pertama-tama DNA mengalami denaturasi lalu memasuki fase penempelan, di mana sepasang primer pertama melekat di kedua utas tunggal DNA dan mengamplifikasi DNA di antara kedua primer tersebut dan terbentuklah produk PCR pertama.[3] Kemudian produk PCR pertama tersebut dijalankan pada proses PCR kedua di mana pasangan primer kedua (nested primer) akan mengenali sekuen DNA spesifik yang berada di dalam fragmen produk PCR pertama dan memulai amplifikasi bagian di antara kedua primer tersebut.[3] Hasilnya adalah sekuens DNA yang lebih pendek daripada sekuens DNA hasil PCR pertama.[3]

Aplikasi[sunting | sunting sumber]

Nested PCR memiliki aplikasi yang luas dalam bidang kesehatan dan identifikasi parasit.[4][5] Karena nested PCR memiliki sensitivitas dan spesifitas yang lebih tinggi dibanding PCR biasa, maka hasil yang didapat akan lebih akurat.[4] Keakuratan nested PCR karena daerah yang diinginkan akan diamplifikasi dua kali, dengan dua set primer.[1] Beberapa contoh aplikasinya antara lain adalah dalam mendiagnosis penyakit Extrapulmonary tuberculosis yang disebabkan oleh Mycobacterium tuberculosis, deteksi Taenia solium pada penyakit taeniasis [4], dan diagnosis leptospirosis[5]

Diagnosis penyakit Extrapulmonary tuberculosis sebenarnya bisa saja menggunakan PCR biasa, namun PCR biasa tidak memiliki sensitifitas dan reabilitas setinggi nested PCR untuk mendiagnosis dengan akurat.[6] Kekurangan PCR ini berhubungan dengan kondisi pengambilan sampel yang heterogen, adanya faktor yang memengaruhi amplifikasi, dan hilangnya patogen selama proses.[6] Berhubungan dengan hal tersebut, maka disimpulkan bahwa PCR yang biasa digunakan tidak memiliki sensitifitas dan reabilitas yang tinggi.[6] Tes ini didasarkan pada amplifikasi fragmen 986.[6]

Keunggulan lain nested PCR adalah proses yang tidak memakan banyak waktu dibandingkan dengan proses lainnya, seperti teknik kultur biasa.[7] Pada diagnosis penyakit Extrapulmonary tuberculosis ini, dibandingkan efektivitas antara teknik nested PCR yang menargetkan gen MPB64 dari Mycobacterium tuberculosis dan teknik kultur pada media Lowenstein Jensen (LJ) medium.[7] Percobaan ini melibatkan 400 sampel klinis yang diduga sakit extrapulmonary tuberculosis dan 30 spesimen kontrol non tuberculosis yang kemudian dikultur dan dideteksi dengan nested PCR.[7] Pada perbandingan hasil antara teknik kultur pada media LJ dengan nested PCR, hasil dari teknik kultur pada media LJ dari 400 spesimen klinis hanya 16 spesimen yang menunjukkan hasil positif.[7] Pada hasil dari nested PCR, dari 400 spesimen klinis terdapat 141 hasil positif (35.2 %).[7] Sedangkan, pada spesimen kontrol hasilnya negatif dengan nested PCR.[7] Pada percobaan ini dapat dilihat bahwa nested PCR memiliki keakuratan dan sensitivitas yang tinggi, serta tidak memakan waktu, terlebih dibandingkan dengan metode kultur konvensional.[7]

Referensi[sunting | sunting sumber]

  1. ^ a b c d e f g h i j k l (Inggris) PCRstation. 2009. Nested PCR [terhubung berkala]. http://www.pcrstation.com/nested-pcr/ [26 Apr 2009].
  2. ^ a b c (Inggris) Chauhan HC, Kher HN, Chandel BS, Dadawala AL, Jain L, Agrawal SM, Bhadaniya A. 2009. Evaluation of group specific nested pcr for detection of bluetongue virus. Veterinary World 2(5):179-182.
  3. ^ a b c d e (Inggris) Louise AM, Scott AA, Patricia BM, Stephen JR, Mark C, Martin OS, Shern LC, Adrian JLC. 2001. Pseudoexon Activation as a Novel Mechanism for Disease Resulting in Atypical Growth-Hormone Insensitivity. Am. J. Hum. Genet. 69:641–46.
  4. ^ a b c (Inggris) Mayta H et al. 2008. Nested PCR for specific diagnosis of Taenia solium Taeniasis. J Clin Microbiol 46(1):286-289.
  5. ^ a b (Inggris) Nassi F. 2003. Leptospirosis diagnosis using Nested-PCR. Braz. J. Microbiol. 34(1):90-92.
  6. ^ a b c d (Inggris) Skotnikova OI etal. 1999. Application of Nested PCR technique for the diagnosis of Tuberculosis. Bulletin of experimental biology and medicine 129 (6):612-614.
  7. ^ a b c d e f g (Inggris) Therese KL,Jayanthi U, Madhavan HN. 2005. Application of Nested Polymerase Chain Reaction (nPCR) Using MPB 64 Gene Primers to Detect Mycobacterium Tuberculosis DNA in Clinical Specimens From Extrapulmonary Tuberculosis Patients. Indian J Med Res. 122:165–170.